關鍵詞：tiki1 基因打靶 豬模型 

摘要：Tiki1基因是哈佛大學兒童醫學院賀熹教授實驗室發現的一個對蛙頭部的誘導起到決定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等嚙齒類動物中缺失,因此無法利用小鼠等小動物來研究其在哺乳動物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系統結合體細胞克隆技術構建Tiki1基因修飾豬模型,研究Tiki1基因在豬發育中的作用.我們利用賀熹教授團隊提供的人Tiki1基因序列,在豬的基因組數據庫中比對出與其同源性最高的一段序列設計2個靶位點(g1和g2).以設計的靶位點構建打靶質粒轉染豬胎兒成纖維細胞,經細胞篩選、PCR擴增及測序共鑒定了52個單細胞克隆株.最終選擇靶位點g1為純合雙敲的5個單細胞克隆株和靶位點g2為純合雙敲的3個單細胞克隆株作為構建Tiki1基因敲除豬的核供體.我們共計構建了720個重組胚胎,分別植入3頭代孕母豬,其中有1頭經B超檢測成功懷孕并妊娠到期產下13頭發育正常的克隆豬,經測序鑒定其中12頭為Tiki1基因雙敲除豬模型,Tiki1基因敲除克隆豬健康存活至今.結果表明Tiki1基因對于豬早期發育的作用機理不同于蛙,其在豬早期發育的過程中的具體作用機理有待后續進一步的深入研究.

生物化學與生物物理進展雜志要求:

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