關(guān)鍵詞：蔗糖磷酸化酶 酶學(xué)性質(zhì) 分子改造 轉(zhuǎn)糖苷 

摘要：【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要來源之一。此酶能以較廉價的蔗糖為底物進行轉(zhuǎn)葡萄糖基反應(yīng),改善受體底物的理化性質(zhì),因而具有重要的應(yīng)用價值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶學(xué)性質(zhì)和轉(zhuǎn)糖苷活性,為其更優(yōu)質(zhì)的改造提供材料和理論基礎(chǔ)。【方法】將宏基因組中獲得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表達載體上構(gòu)建重組大腸桿菌,誘導(dǎo)表達并進行鎳親和層析純化蛋白。以蔗糖為底物測量重組酶的基本酶學(xué)性質(zhì),研究其對糖類底物的轉(zhuǎn)糖苷活性。通過底物通道分析,利用反向PCR技術(shù)對其第155位點進行飽和突變,并測定突變體基本酶學(xué)性質(zhì)和轉(zhuǎn)糖苷活性。【結(jié)果】純化的酶蛋白分子量大小約為56 kD,活性狀態(tài)時以三聚體形式存在。在以蔗糖為底物時,最適溫度和最適pH值分別為55°C和6.5;Km和Vmax值分別為23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),對第155位點進行了定點飽和突變,獲得了部分酶學(xué)性質(zhì)或轉(zhuǎn)糖苷活性改善的突變體。【結(jié)論】宏基因組中蔗糖磷酸化酶的研究豐富了酶學(xué)數(shù)據(jù),并通過分子改造獲得了部分性質(zhì)更優(yōu)的突變體,為轉(zhuǎn)糖苷活性關(guān)鍵氨基酸的研究和該酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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