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BMSCs向某一特定細胞的分化,必須依靠相應微環境所提供的各種營養因子來完成。原始視網膜發育的微環境是最適宜的微環境,這種微環境提供了BMSCs定向誘導分化所具備的各種生長因子以及營養成分。人工誘導分化干細胞的方法,就是對這種微環境的模擬。模擬的準確性越高,分化效率也就越高。
1.1單用誘導介質
1.1.1堿性成纖維細胞生長因子(bFGF):堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)誘導方法是誘導BMSCs向神經元方向分化的經典方法,其優點是可以獲得較多的神經元樣細胞,分化的陽性率為78%。劉東寧等[1]用bFGF誘導后結果與Woodbury一致。用bFGF誘導后細胞GFAP表達陰性,認為主要是向成熟神經元方向分化,而不是神經膠質細胞。誘導后從形態學上在細胞間建立了突觸聯系,但誘導后細胞難以長期存活,需聯合其他神經營養因子進行維持培養,才利于長期存活。在培養中,劉東寧等用含10 ng/mL bFGF進行接觸性的誘導,有報道是用20 ng/mL bFGF進行接觸性的誘導。
1.1.2乳鼠視網膜細胞:采用新出生1~3天的乳鼠視網膜細胞作為誘導劑。有學者把將視網膜神經細胞培養換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中,真空抽濾后按2∶3比例與DMEM培養液混合后備用。用上述混合液進行BMSC細胞的誘導分化,倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及分化情況。徐春玲等[2]是
將新出生1~3天的乳鼠視網膜細胞置于Transwell雙層培養板的上層,這些尚未成熟的視網膜組織內尚存在一些促進原始視網膜干細胞分化和發育的細胞因子及細胞外基質成分,可通過上層的濾膜孔擴散至下層的BMSCs周圍,而上層的乳鼠視網膜細胞卻無法濾過到BMSCs周圍,從而模擬了原始視網膜發育的微環境。BMSCs在此微環境中,分化為具有神經細胞形態特征的神經樣細胞。實驗組誘導3d后,檢測到RGCs標志物Nestin陽性細胞的表達,比率為30.9%±7.7%,但7d后表達減弱(23%±4%)。
1.1.3 activin A、牛磺酸和表皮生長因子(EGF):Anthony等[3]應用activin A、牛磺酸和EGF體外誘導分化后,發現有20%~32%的細胞在體外可表達感光細胞特異標志――視紫紅質、視蛋白和recoverin。將MSC植入RCS大鼠視網膜下腔內,移植入視網膜下腔的MSC未表達細胞增殖的標志,說明MSC在移植入視網膜下腔后經歷的是分化的過程而非增殖。這與Kicic A實驗的結果一致。
還有,Woodbury等利用BME、DOSO、BHA為誘導劑將BMSCs誘導成為神經樣細胞。還有人利用中藥,如人參、丹參、當歸、黃芪等誘導BMSCs為神經樣細胞。
2 借用支架培養
2.1三維支架的選擇
三維支架培養是組織工程中最典型的培養方式,使細胞間形成適宜的空間分布和細胞連接,而且為細胞提供特異性的生長和分化信號,形成與體內相似的細胞生長微環境,引導組織形成。近年來,BMSCs的三維培養已用于骨、軟骨、肌腱和脂肪等組織的工程研究,其主要的支架材料為明膠海綿、水凝膠、β-磷酸三鈣及聚己內酯等。但應用在神經元細胞上未見相關報道。
羊膜(human amniotic membrane,HAM)基質:王晶等[4]采用人的HAM基質負載BMSCs定向誘導分化為神經元樣細胞。在實驗中,觀察到BMSCs接種到HAM基質上后能很快貼附生長,細胞活力好,折光性強,第3-10天可在HAM基
質面密集生長,這與張妍等報道相同。王晶等則認為,把HAM基質作為細胞培養載體具有以下的優點:HAM基質主要成分為膠原纖維和網狀纖維,其三維支架結構為神經元樣細胞及其軸突的生長提供了廣闊的空間;HAM基質免疫原性低,具有良好的生物相容性和抗炎性;HAM基質內的EGF、bFGF等多種生長因子為細胞的增生和分化提供了豐富的營養成分,HAM內可能產生的某種未知的有很強神經保護作用的因子,為神經元樣細胞及其軸突的生長提供了更多的營養支持。
2.2三維支架的誘導劑
王晶等[4]以HAM基質作為載體,以新出生1~3 d的乳鼠視網膜細胞作為誘導劑進行非接觸培養。以HAM基質為載體,以2-巰基乙醇(DMEM/F12)接觸培養將其誘導定向分化成神經樣細胞。關于二種實驗方法的效果比較未見相關報道。也未見借用HAM基質作為載體和單用乳鼠視網膜細胞作為誘導劑這二種誘導方式效果比較的相關報道。
3 BMSCs體內移植實驗
BMSCs移植入體后,如何從受體辨別供體干細胞,并觀察其在體內的遷移變化情況,一直是讓人困擾的問題。近年來,主要運用的標記物有以下幾種。
3.1 超順磁性鐵納米顆粒(SPIO)。SPIO是研究發現的新型磁共振陰性對比劑,可在活體標記神經干細胞。Frank等研究發現SPIO顆粒與轉染試劑結合后標記干細胞比使用單純SPIO顆粒高100倍。陳舒澤等[5]研究發現,SPIO的濃度對此有至關重要的影響:濃度過低無法達到較高的標記效率滿足MR的需要。在標記濃度為11.2mg/L左右時,既能達到較高的標記效率,又不影響視網膜前體細胞的體外生長增殖,但這與有些文獻報道不同。轉染劑結合SPIO并無短期或長期毒性作用。
3.2 溴脫氧尿嘧啶(BrdU)。BrdU是胸腺嘧啶類似物,移植的細胞與含有BrdU的培養基一起孵育,讓它取代胸腺嘧啶而摻入處于DNA合成期細胞的DNA中作為標記,用免疫熒光或免疫組織化學顯示移植的細胞。BrdU作為標記應選擇適當的濃度,采用質量濃度為10μg/mL的BrdU標記的了BMSCs與未做標記的細胞生長情況基本相同,在熒光顯微鏡下可見BrdU標記的MSCs細胞核被染色,未做標記的細胞不著色。
3.3 細胞熒光黃(LY)。顯微鏡下選取誘導后1 d形態和活性良好的細胞,將細胞爬片置于灌流槽中。電極拉制器拉制玻璃毛細管微電極,注入電極液后電阻范圍為8~12mΩ。調節微操縱器,使電極尖端接近細胞,利用特定的測試方波電脈沖形成封接,在電極尖端接觸細胞表面之前,向微電極加正壓。當接近細胞時,給予短暫負壓吸引。當電極尖端與細胞膜表面形成1~5 gΩ封接電阻時,用力吸破電極尖端上的膜片,LY通過記錄電極尖端擴散入所記錄的細胞內,5~10min后,在Leica熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍片。
3.4 視網膜電圖。視網膜電圖是客觀有效地反映視網膜功能變化的一個敏感指標,b波反映了視網膜內核層區域細胞的電活動,是視網膜缺血的敏感指標。用視網膜電圖、b波觀察骨髓間充質干細胞視網膜下移植對大鼠視網膜缺血再灌注損傷的影響。
3.5 熒光染料。4,6-二脒222苯基吲哚(DAPI)是一種藍色熒光染料,可被不同時期的細胞攝取并與DNA結合。把(DAP I)儲存液(Sigma)加入第2代BMSCs培養液中,至終濃度為50mg/L,37℃孵育染色1 h,Hanks平衡液沖洗6遍,消化、離心收集細胞,重懸于PBS中(106個/mL),置于冰上待用,然后采用標記細胞直接在熒光顯微鏡下識別,陽性率達100%。神經節細胞密度與內層視網膜厚度是檢測視網膜損傷修復程度的常用指標。用蘇木精-伊紅染色研究內核層細胞結構和排列情況,用尼氏染色是對視網膜神經節細胞進行定量研究。還有用綠色熒光染料(PKH-67)標記了BMSCs進行實驗。
4 動物模型與結果
4.1 正常模型
張枝橋等[6]把MSCs移植到同種異體成年大鼠視網膜下腔后14 d,主要分布于RPE層和視錐、視桿細胞層,證明MSCs能夠在視網膜下腔存活并能與原視網膜結構相融合;免疫熒光結果顯示,移植后的MSCs細胞并未表達光感受器細胞的特異性抗原Rhodopsin。對于這一陰性結果,認為原因可能有以下兩點:一是由于實驗條件所限,觀察時間太短,移植后的BMSCs可能還來不及發生分化,這一點可在下一步的實驗中通過延長觀察時間來證實。二是本實驗選用的受體為正常的成年大鼠,正常成年大鼠的視網膜與新生大鼠視網膜及非健康的大鼠視網膜相比,后者的微環境更有利于移植細胞的遷移、整合、分化,在這一微環境中起主要作用的可能是一些生長因子,如bFGF、NGF、GDNF、BDNF和CNTF等。而在正常成年大鼠的視網膜中,這些生長因子的水平相對較低,對移植細胞產生的趨化作用較弱,不利于移植細胞的整合、分化。大鼠MSCs移植于正常和Nd:YAG激光損傷后的大鼠視網膜下5周,MSCs可與原視網膜結構相融合分布于RPE層、視細胞層、雙極細胞層及節細胞層,ERG檢測表明損傷移植組的b波水平高于對照組。
4.2 損傷模型
光損傷模型:張鈺等[7]光損傷模型的制作:除N組外的SD大鼠經過24 h暗適應,被放入光損傷儀中(北京大學醫學部儀器廠制作)光照24 h,光照強度為(950±50)lx,波長為480~520 nm,光照后置于黑暗中3 d,此后恢復到正常光環境,并在視網膜下移植BMSCs,研究結果發現,BMSCs可能是通過其分泌的細胞因子bFGF發揮其營養支持作用,從而對光感受器細胞產生保護作用,抑制了光損傷大鼠光感受器細胞的凋亡,但BMSC并沒有整合到大鼠視網膜組織中起替代作用。
注射3%NaIO3損傷RPE模型:在Lewis大鼠腹腔注射3%NaIO3(100mg/kg)建立大鼠RP模型,將體外培養的BMSCs植入視網膜下腔,術后第1周即可見BMSCs主要分布于RPE層和視錐、視桿細胞層,并從第3周開始表達RPE細胞及光感受器細胞的表面標志,但尚未需從功能上進行驗證。龔莉華等[8]用同一方法研究發現,誘導后的細胞表達RPE細胞、光感受器細胞和星形膠質細胞的特異性標志,但沒有整合入神經視網膜層,也沒有證據支持其分化為光感受器細胞。
視網膜缺血再灌注動物模型:用血管結扎法建立視網膜缺血再灌注損傷模型。即是分離、暴露視神經,在其根部用3/0滌綸線打活結,60 min后拆除結扎線,恢復血流。缺血再灌注損傷后28 d后視網膜下移植骨髓間充質干細胞組與非移植組相比,移植組視網膜電圖b波增高,組織結構破壞不顯著,內層視網膜厚度顯著增厚,研究認為骨髓間充質干細胞對視網膜缺血再灌注損傷有神經保護作用,且該作用與骨髓間充質干細胞移植有關,而與磷酸鹽緩沖液無關。王陸飛等[9]眼缺血再灌注損傷的實驗模型是在右眼角鞏膜緣穿刺,注入BSS平衡鹽溶液,用間接檢眼鏡觀察,當眼內壓上升到80 mmHg維持約60 min時,間接檢眼鏡下可見視網膜血管阻塞,視網膜變白,也可發現虹膜變白,此時終止眼內灌注。以間接檢眼鏡確定血管再充盈后,用Br2dU標記的BMSCs進行視網膜下移植。然后做了BrdU陽性細胞連續切片的免疫組化染色,發現BMSCs在視網膜下移植后有一部分參與了視網膜的重建,一部分參與了損傷的增生,還有一部分形成了新的節細胞層增生。BMSCs的參與可以緩解缺血對視網膜神經節細胞的損傷,具有向損傷部位遷移的能力。證明了BMSCs能夠在視網膜下存活并能與原視網膜結構相融合,初步判斷形成的視網膜樣結構具有神經細胞特性,但尚不能確定這種新形成結構是否能夠建立一定的神經傳導。
5 鑒定
鑒定指標有以下幾種:(1)Nestin:為神經巢蛋白,是神經上皮干細胞蛋白,屬于中間絲蛋白,只在多潛能的神經外胚層細胞中表達,是神經干細胞特有的生物學標記。(2)生長相關蛋白(GAP-43):是一種細胞骨架蛋白,特異性地分布于神經元胞體及突起中,是軸突成熟的標志之一,國際上將GAP-43列為研究神經生長發育和損傷修復等神經可塑性的首選分子標志物。(3)神經絲(Neurofilament,NF):屬于中間絲家族的第Ⅳ型,廣泛分布于成熟神經元中。(4)視網膜神經節細胞的特異性標志物Thy111檢測。但大部分的學者只用其中一種或幾種:王晶等[4]用免疫組織化學方法測定分化所得細胞的Nestin、NF表達;或應用免疫組織化學方法檢測神經上皮干細胞蛋白Nestin、神經元特異性標記物GAP-43的表達;劉東寧等[1]則檢測Thy111表達。
6 討論
大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化出視網膜神經樣細胞為視神經損傷等疾病的治療提供了新的方法。然而,由于對MSC來源的分化研究尚處于初級階段。盡管近年來對MSC的研究取得了很大進展,但仍然存在以下問題尚待解決:
(1)不同條件誘導骨骼間充質干細胞定向分化成視網膜細胞所需微環境的是否存在蛋白差異,未被證實。
(2)還未形成相對有統一的、高效的誘導劑與誘導方法,未形成相對統一條件培養劑。
(3)體內實驗中損傷模型的仿真程度還未經進行實驗證實。正常視網膜與病變視網膜以及不同病變視網膜間的微環境對移植細胞的影響有何不同?
(4)雖然檢測到了RGCs標志物的表達,但未能在功能學以及電生理學等方面上證實視網膜神經節樣細胞的功能。所以,骨髓間充質干細胞其分化成的視網膜神經細胞是否具有特定的功能,移植后與宿主神經細胞整合發揮修復作用等尚有待進一步研究。
(5)骨髓間充質干細胞對光感受器細胞產生保護作用機制未明了。是通過其分泌的細胞因子發揮其營養支持作用,還是整合到大鼠視網膜組織中起替代作用,還在探討中。
雖然MSCs移植目前尚不能應用于眼科臨床,但是已經取得的研究成果表明MSCs移植有可能成為治療視網膜變性疾病的新的有效途徑。
參考文獻:
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三三令節春時松更高,九九芳辰重陽鶴添壽,愿秋風捎去我的思念和祝福,祝你越活越精神,越活越年輕!
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女:在此我們祝愿天下所有的老人們幸福安康!(鞠躬) 女:把已有近兩千年歷史的九九重陽節定為老人節,展示了黨和政府對于老齡工作的關心和支持。
男:再過幾天就是你們的節日,
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男:一、參加本次活動的學校領導有:書記校長XX、副校長XX、副校長XX、副校長XX、還有我們全體退休領導、退休教師和老師的爸爸和媽媽們,歡迎您們的到來(鞠躬)
女:二、《歲歲重陽,今又重陽》,有請XX老師誦詩致敬!(背景音樂)
男:三、下面掌聲有請XX校長重陽節致辭
女:四、下面有請退休教師代表發言
男:五、下面有請教師代表XX做感恩父母發言(背景音樂父親或母親)
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4、重陽將來到,快樂步步高。人間重晚晴,殷殷寸草心。霜葉紅勝花,歲歲好年華。莫道桑榆晚,幸福金不換。愿你重陽享安康,吉祥伴身旁。
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4、九九重陽佳節,想約你一起來過節,但一采就碎,菊酒一喝就醉,外出旅游太貴,登高遠眺太累,不如發條微信經濟又實惠,祝你重陽過得輕松愉快。
5、重陽佳節聚,九九登高望,望見祥云千里把您罩,望見您桌前食美果飄香,望見您兒孫繞膝幸福享,望見您歲歲安樂享重陽。
6、重陽節到了,不管三七二十一,還是九九八十一,平安才是唯一。年齡存進銀行,健康就是利息;重陽當成六一,七十也變十七。祝您心情永遠美麗。
7、歲歲重陽,今又重陽,誰道秋日涼?重陽節里歌聲放,祝福飛來心飛揚。九月九里共舉杯,聲聲祝福暖心扉。微信送到你這里,祝福也能化傷悲。
8、年年歲歲花相似,歲歲年年人不同,重陽節到了,親朋好友聚在一起賞菊插茱萸,體味一年一年大家的經歷與心情,祝愿大家身體健康,重陽節快樂。
“人生易老天難老,歲歲重陽,今又重陽,戰地黃花分外香。”光陰似箭,日月如梭。轉眼到了重陽,我要懷著感恩的心謝謝奶奶。
重陽節到了,這是老人的節日。想到奶奶常常給我們好吃的,過年的時候給我們豐厚的壓歲錢,生病時無微不至的照顧我們,晚上讓我們吃熱騰騰的飯菜……他們是如此的疼愛我們。今天我要去陪陪她。奶奶從地里回來,累的滿頭大汗,我給她倒一杯水,遞到她的手上。奶奶笑瞇瞇的說:“孫女兒,你長大了。”我甜甜的笑了:“奶奶,節日快樂。”奶奶聽了,笑得像年輕的小姑娘,真美。
祝愿天下的老人重陽節快樂。
作者:池州市東至縣大渡口鎮中心小學304班曹敏
指導老師:童心樂作文英語培訓中心張老師
老師們、同學們,早上好!
今天我發言的主題是:重陽盡孝心,楓紅愛更濃。
楓葉正紅時,又是重陽節。再過幾天就到重陽佳節了。可能還有同學不知道重陽節的來歷吧?重陽節就是農歷九月初九,為什么會是九月初九呢?古老的《易經》把“六”定為陰數,把“九”定為陽數,九月初九,日月并陽,兩九相重,故而叫重陽,也叫重九。九九重陽,因與“久久”同音,九在數字中又為最大數,故有長久、長壽之意,故且秋季也是一年中收獲的黃金季節,其寓意就深遠了。1989年起,重陽節又被賦予了新的含義,被國家定為敬老節,成為人們尊老、敬老、愛老、助老、盡孝道表孝心、弘揚傳統美德的節日。
老師們、同學們!普天之下的每一位慈母嚴父,都值得尊敬,值得愛戴。當歲月的痕跡悄悄爬上那嬌美的容顏,當山一樣偉岸挺拔的腰身漸漸佝僂,當曾經火紅的青春悄然離他們遠去,他們卻沒有絲毫遺憾,沒有任何抱怨。他們用那無私的奉獻和深沉的愛心,撫育著我們成長,包容著我們的錯誤。我們的平安,我們的健康,我們的成功,我們的幸福……我們在人生之路上取得的點點滴滴的成績,都包含著慈母嚴父那沉甸甸的愛!可是,我們又給與了父母什么?我們的父母一生都在毫無保留地付出,卻從沒想過要得到任何回報!在這個重陽節,難道我們不應該為父母做些什么嗎?來吧,用最樸素的方式獻給父母一份孝心;拿起你手中的筆,寫幾句感恩的話語;舉起你的手,為父母捶兩下背、揉幾下腰、洗一下腳;拿起你的相機,給父母留下一份美好的回憶!只要我們真心的做了,你就能得到一筆珍貴的財富!
老師們、同學們!快行動起來吧!關愛老人,始于足下;孝敬父母,從我做起,從小做起,從心做起!
企業機關重陽節領導發言稿范文二
尊敬的各位老領導,同志們:
歲歲重陽,今又重陽。今天,我們與各位老領導、老同志歡聚一堂,共慶我國傳統節日重陽佳節,感到由衷的高興。在此,我代表區委辦公室全體職工向你們表示節日的慰問,并致以崇高的敬意!
我雖然有多年在區政府辦公室工作的經歷,但對區委辦公室的工作,較為陌生,可以說還是一名新兵。我也深知,區委辦公室所取得的每一點成績和進步,都離不開各位老領導的關心、理解和支持。在這里,我也希望各位老領導、老同志一如既往地關注區委辦公室,為我們工作把關定向。我們一定以各位老領導為榜樣,繼續保持和發揚黨的優良傳統和作風,不斷推進區委辦公室工作。
人生易老天難老,今也重陽明也重陽,歲歲重陽;容顏易變情難變,早也想念晚也想念,天天想念;歲月易失友難失,朝也問候夕也問候,時時問候。重陽快樂。
人生易老情難老,歲歲重陽,今又重陽,知交故友憶如常;一年一度秋風勁,季節在長,思念在長,友情如酒菊更香。九九重陽,祝愿你節日快樂、幸福滿堂!
人生是場旅行,總有些難忘的風景;相逢是那樣美妙,相知是那樣美好;工作固然重要,心情也要調好;偶爾發個祝福短信,算是給你重陽問好!
人生路上大步走,走到重陽九月九,心中懷念老朋友,多日不曾在聚首,心中思念常常有,一句祝福說出口,愿你天天都優秀,快樂幸福最永久!
人生百味。凄冷的日子里,溫暖是心中的家,孤獨的日子里,關懷是心中的家,漂泊的日子里,朋友是心中的家,重陽佳節的日子里,我的問候是你永遠的家。
讓幸福鋪成一張紙,用開心做的墨汁,繪出美好的生活。讓健康的五線譜,配上平安的音符,唱出幸福的歡樂。把糯米磨成粉,用吉祥去搗,吃出重陽的美好!
讓喜羊羊給你帶去聰明,讓懶羊羊給你帶去愜意,讓美羊羊給你帶去漂亮,讓沸羊羊給你帶去勇敢,讓暖羊羊給你帶去溫度,最后讓重陽節給你帶去開心快樂。
讓秋風帶去我的問候,讓秋菊綻放我的關懷,讓秋雨訴說我的思念,讓短信送上我的問候:又到九九重陽,在這個吉利的日子里,祝你開心、快樂!
讓南山上的空氣幫你潤肺,讓解放碑的輕軌載你騰飛,讓瓷器口的雞雜給你美味,讓太白酒的清香把你迷醉,也讓我的祝福帶給你實惠:重陽節快樂!
秋陽撒金光,漫山黃。茱萸插鬢角,米糕抹額旁。登高祈福祉,把酒訴衷腸。少年步步高,老人福壽長。愛情到久久,快樂在重陽。節日快樂!
秋天是一個多思的季節,牽系著想你的心靈。窗前風干的落葉是記憶的書簽,是整個秋天的精美收藏,我沉醉在詩的意境里,把對你重陽的祝福埋藏在心靈深處!
秋天晴空萬里,秋雨綿綿無期,秋雁向南飛去,秋葉零落成泥,秋水奔流不息,秋思濃濃想你,夜里睡覺記得蓋被,重陽登高記得添衣,重陽節快樂!
秋天來了,豐收的時候還會遠嗎?重陽來了,團聚的日子還會遠嗎?愿我的朋友笑容燦爛,每天都有一個好心情。拋開煩惱,時刻都能開開心心。
秋天的色彩,是那陽光般的金黃,比春天的綠色多了一份成熟,更多了一份喜悅,在這霜天季節里,顯得奪目異常,重陽節,祝愿您健康長壽,成就夢想!
秋天到,重陽到,茶里品味到;九九來,喜慶來,祝你重陽好運來。愿你今朝重陽今朝樂,明朝依舊笑春風,歲歲平安精神好,時時福氣樂淘淘。
秋水長天晚生風,寒雁一向南飛去,游人幾度賞花叢,爭艷芳菲季,短信一條獻上禮,夕陽無限秋光好,幸福健康屬于你。重陽快樂。